+ 375 17 283 17 38

+ 375 17 283 17 38

RU EN   

Изучение экстрактов омелы (Viscum album)

Изучение экстрактов омелы (Viscum album)

Январь 2012 г.          Том 26            Издание 1 ISSN 0951-418X

«PHYTOTHERAPY RESEARCH» (Исследования по фитотерапии)

Международный журнал, посвященный клинической и фармакологической оценке растительных лекарственных средств, нутрицевтиков и производных лекарственных средств природного происхождения

Источник -www.interscience.wiley.com/journal/ptr,  перепечатанная статья

 Исследование в области фитотерапии для оценки экстрактов омелы (Viscum album) на предмет взаимодействия «растение - лекарственный препарат» посредством ингибирования и индукции активности цитохрома P450

 Йоганнес Доймер и Юрген Вейсенбраун

 Издательство «WILEY BLACKWELL»

«PHYTOTHERAPY RESEARCH»

Phytother. Res. 26:11–17 (2012)

Опубликован он-лайн 28 апреля 2011 г. в он он-лайн библиотеке «Wiley»

(wileyonlinelibrary.com) DOI: 10.1002/ptr.3473

Изучение экстрактов омелы (Viscum album) на предмет взаимодействия “растение - лекарственный препарат” посредством ингибирования и индукции активности цитохрома P450

Йоганнес Доэймер1 и Юрген Айсенбраун2

1«БиоПруф АГ», Вайхенстефанер Штрассе 28, 81673 Мюнхен, Германия

2«АБНОБА ГмбХ», Хоэнцоллернштрассе 16, 75177 Пфорцхайм, Германия

In vitro проводилось испытание  трех имеющихся в продаже экстрактов омелы (Viscum album L.), выращенной на ясене (абнобаВИСКУМ® Фраксини 20 мг), на ели (абнобаВИСКУМ® Абиентис 20 мг) и на сосне (абнобаВИСКУМ® Пини 20 мг), на предмет их способности влиять на основные цитохромы P450, при участии которых происходит метаболизм лекарственных препаратов, через изменение жизнеспособности гепатоцитов, ингибирование цитохромов P450 1A2, 2A6, 2B6, 2C8, 2C9, 2C19, 2D6, 2E1 и 3A4 и через индукцию цитохромов P450, 1A2, 2B6, 2C9, 2E1 и 3A4. Так как три экстракта были получены из растений омелы, принадлежащих к трем различным подвидам Viscum album L., они имеют явные отличия в содержании и спектре различных активных ингредиентов, например, специфических лектинов омелы. Цитотоксические эффекты на клетки печени наблюдались у абнобаВИСКУМ® Фраксини с высоким содержанием лектинов при значении EC50 2,56 мкг/мл,  у абнобаВИСКУМ® Абиентис с умеренным содержанием лектинов при значении EC50 5,79 мкг/мл и у абнобаВИСКУМ® Пини с низким содержанием лектинов при значении EC50 30,89 мкг/мл. Индукция цитохромов P450 исследовалась на клетках печени человека от трех доноров. Исследование ингибирования цитохромов P450 проводилось на микросомах печени человека. Для всех трех экстрактов не наблюдались вовсе или наблюдались выраженные в незначительной степени индукция и ингибирование. Данные указывают на отсутствие или незначительное потенциальное взаимодействие «растение – лекарственный препарат» посредством влияния на цитохромы P450  любого из трех экстрактов омелы. Авторское право © 2011 Издательство «JohnWiley &Sons, Ltd»

Ключевые слова: экстракт омелы; взаимодействие «растение – лекарственный препарат»; жизнеспособность гепатоцитов; ингибирование цитохрома P450; индукция цитохрома P450.

ВВЕДЕНИЕ

Экстракты омелы (Viscum album L.) назначаются  в качестве дополнительного лекарственного средства в терапии рака на протяжении более чем 80 лет (Kienle and Kiene, 2010), нередко они назначаются одновременно с различными химиотерапевтическими препаратами. Как и при назначении любого другого растительного препарата, необходимо проявлять бдительность, и основное беспокойство связано с тем, что фармакокинетика и эффективность этих препаратов меняются вследствие ингибирования или индукции цитохромов P450. Классическим примером является зверобой, для которого выраженное изменение фармакокинетических свойств различных лекарственных препаратов вследствие индукции или ингибирования цитохрома P450 было широко описано во многих исследованиях (Mathijssen et al., 2002).

Целью этого исследования было оценивать препараты омелы, абнобаВИСКУМ® Фраксини, абнобаВИСКУМ® Абиентис и абнобаВИСКУМ® Пини, на предмет их способности вмешиваться в метаболизм лекарственных препаратов посредством ингибирования или индукции цитохромов P450, в соответствии с руководствами для скринига in vitro на предмет лекарственных взаимодействий (EMEA, 1997; FDA, 2006; BfArM, 2004). Эти три препарата представляют три подвида (ssp.) омелы (Viscum album), используемые для производства препаратов абнобаВИСКУМ. Омела с ясеня, используемая для препарата абнобаВИСКУМ Фраксини принадлежит к подвиду Album, Viscum album L. Омела, растущая на деревьях ели, принадлежит к подвиду Abientis, Viscum album L. Омела с сосны для препаратов абнобаВИСКУМ Пини принадлежит к подвиду Austriacum, Viscum album L. Существуют определенные различия между препаратами трех подвидов омелы в содержании и спектре активных ингредиентов, например, лектинов (Scheer et al., 1995). Для того, чтобы выявить все различия в цитотоксичности и потенциале метаболического взаимодействия, проводилась оценка всех трех препаратов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Экстракт омелы. Водные экстракты омелы абнобаВИСКУМ® Абиентис 20 мг, партия №712 B14; абнобаВИСКУМ® Фраксини 20 мг, партия №804 A28; и абнобаВИСКУМ® Пини 20 мг, партия №801B17; были получены от производителя «АБНОБА ГмбХ», Пфорцхайм, Германия. Все три экстракта были произведены в соответствии с Немецкой гомеопатической фармакопеей (правило 32) в виде спрессованного сока и содержат 15 мг экстракта омелы из 20 мг растения омелы. 20 мг - это самая высокая доступная концентрация экстрактов абнобаВИСКУМ.

Гепатоциты человека. Свеже нанесенные человеческие гепатоциты для исследований индукции от трех доноров (3×105 клеток на лунку, на планшете на 24  лунки, номера серий: 23206-9706 (донор I); 23226-6721 (донор 2); 23262-8346 (донор 3)) поставлялись компанией «Гепакульт ГмбХ», Регенсбург, Германия.

Микросомы печени человека. Микросомы человеческой печени поставлялись компанией «БД Биосайенсиз», Уобурн, США, в виде объединенных микросом  печени человека  обоих полов, номер по каталогу 452156, номера партий 18888, 28831, 88114 и 99268. До использования они хранились при температуре -80°C.

Химические реагенты, используемые для MTT-анализа. Среда InVitro Gro HI, номер по каталогу Z99009 «Цельсис ИнВитро ГмбХ», Неусс, Германия; пенициллин/стрептомицин, номер по каталогу P11-010 «ПААЛ Лабораториз ГмбХ», Пашинг, Австрия; дексаметазон, номер по каталогу D9184 «Сигма-Олдрич», Тауфкирхен, Германия; MTT, номер по каталогу A2231, «Апплихем», Дармштадт, Германия; додецилсульфат натрия (SDS), номер по каталогу A2572, «Апплихем», Дармштадт, Германия; N,N-диметилформамид, номер по каталогу A3725, «Апплихем», Дармштадт, Германия; уксусная кислота, номер по каталогу 49199, «Флука»/«Сигма-Олдрич», Тауфкирхен, Германия; фосфатный буферный раствор (PBS), номер по каталогу VX10010015 «Инвитроген ГмбХ», Карлсруэ, Германия; этанол, номер по каталогу 1.00983 «Мерк», Дармштадт, Германия; натрия фторид, норме партии B481 «Мерк», Дармштадт, Германия.

Химические реагенты, используемые в исследованиях ингибирования.

Аммония ацетат p.a., номер по каталогу 49638, «Флука», («Сигма-Олдрич»), Тауфкирхен, Германия; MgCl2 , номер по каталогу 63063 «Флука», Бухз, Швейцария; калий-фосфатный буфер, 0,5M, pH 7,4, номер по каталогу 451201, и тетранатриевая соль b-НАДФ-H, номер по каталогу A1395, «БД Биосайенсиз», Хайдельберг, Германия; ацетонитрил, номер по каталогу 01207802LC/MS «АпплиХем ГмбХ», Дармштадт, Германия; муравьиная кислота, ULC/MS, номер по каталогу 06914131, изопропанол, ULC/MS, номер по каталогу 16264102, метанол, абсолютный LC/MS, номер по каталогу 13687082, вода,ULC/MS, номер по каталогу 23214125, «Биосолв», Валкенсваард, Нидерланды.

Химические реагенты, используемые в исследованиях индукции. Среда InVitro Gro HI, номер по каталогу Z99009, «Цельсис ИнВитро ГмбХ», Неусс, Германия; пенициллин/стрептомицин, номер по каталогу P11-010 «ПААЛ Лабораториз ГмбХ», Пашинг, Австрия; дексаметазон, номер по каталогу D9184, ДМСО, номер по каталогу 472301, салициламид, номер по каталогу 86,041-7, и буферный раствор Кребса-Хемзелайта, номер по каталогу K3753 «Сигма-Олдрич», Тауфкирхен, Германия; этанол, номер по каталогу 000983 «Мерк»; ацетонитрил, LC/MS номер по каталогу 01207802, муравьиная кислота, ULC/MS, номер по каталогу 06914131, и метанол, абсолютный LC/MS, номер по каталогу 13687082, «Биосолв», Валкенсваард, Нидерланды; эмбриональная телячья сыворотка, номер по каталогу10270-106, «Инвитроген ГмбХ», Карлсруэ, Германия.

Вещества-маркеры, метаболиты и внутренние стандарты. Фенацетин, содержание 99,4 % номер партии S32704, «Флука»; ацетаминофен, содержание 99,9 %, номер партии 115K0098, «Сигма-Олдрич»; ацетаминофен-d4, содержание 98,0%, партия №8-SSR44-1, «TRC»; кумарин, содержание 100,0 %, серия № 056K1129, «Сигма»; 7OH-кумарин, содержание 98,7 %, S34889, «Олдрич»; бупропион HCl, содержание 98,0 %, номер партии 31677-93-7, «TRC»; OH-бупропион, содержание 98,0 %, партия №00081, BD; OH-бупропион-d6, содержание 98,0 %, партия №78308, BD; паклитаксел, содержание 99,2 %, номер партии HOG193 USP; 6α-OH-паклитаксел, содержание 98,0 %, номер партии 3-JQW-112-9, «TRC»; доцетаксел, содержание 99,3 %, номер партии 1343815, «Флука»; диклофенака натриевая соль, содержание 99 %, номер партии 075K1896, «Сигма»; 4-OH-диклофенак-13C6, содержание 97 %, номер партии 17879, BD; S-мефенитоин, содержание 99,0 %, партия №2-RCD-56-4, «TRC»; 4-OH-мефенитоин, содержание 99,8 %, номер партии 065K3251, «Сигма»; 4-OH-mephenytoin-d3, содержание 99,0 %, номер партии 065K3251, BD; буфуралола гидрохлорид, содержание 97 %, номер партии 6-JWA-170-2, «TRC»; 1-OH-буфуралола малеат, содержание 99 %, номер партии 15537 BD; 1-OH-буфуралол-малеат-d9, содержание 98 %, партия №18657, BD; хлорзоксазон, содержание 100 %, номер партии 1027K1562, «Сигма»; OH-хлорзоксазон, содержание 97,0 %, номер партии 08778 BD; тестостерон, содержание 99,4 %, партия №2099, Ридель де Хайен; 6b-OH-тестостерон, содержание 99,0 %, партия №51730, BD; 6b-OH-тестостерон d7, содержание 99,0 %, номер партии 64732, BD.

Референтные ингибиторы. Фурафиллин, содержание: 99 %, номер партии 98451, BD; 8-метоксипсоралин, содержание: 100 %, номер партии 067K1469, «Сигма»; триэтилентиофосфамид, содержание: 99,1 %, партия номер 107K1444, «Сигма»; кверцетин, содержание: 99 %, номер партии 087K0744, «Сигма»; сульфафеназол, содержание: 99 %, номер партии 056K1246, «Сигма»; омепразол, содержание: 99,9 %, номер партии 086K1405, «Сигма»; хинидин, содержание: 87 %, номер партии 026K1021, «Сигма»; диэтилдитиокарбамат, содержание: 101,2 %, номер партии 1359427, «Сигма»; кетоконазол, содержание: 99 %, номер партии 121H0524, «Сигма».

Референтные индукторы. Рифампицин, содержание: 98 %, партия номер 087K1875, «Сигма»; омепразол, содержание: 99,9 %, партия номер 086K1405, «Сигма»; фенобарбитал, содержание: 100 %, партия номер EPP0900000, «LGC»; этанол, содержание: 100 %, партия номер K38345783, «Мерк».

Исследование цитотоксичности с помощью (MTT-теста). Влияние препаратов омелы на жизнеспособность гепатоцитов оценивалось для того, чтобы установить максимальную концентрацию экстракта, которую можно было бы испытывать без прямого цитотоксического эффекта. Для этой цели использовался MTT- тест (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид). Свеже нанесенные человеческие гепатоциты, взятые у лиц мужского пола засевают в 96-луночные плоскодонные планшеты с  плотностью клеток 105 на лунку и инкубируют с препаратами омелы при 37°С и влажности 95 % в атмосфере 5% СО2 в течение 48 ч., с заменой питательной среды через 24 часа, в диапазоне концентраций 0,002 – 2000 мкг/мл (конечная концентрация) на 100 мкл питательной среды.  Контролем служат интактные клетки печени, адаптированными к питательной среде (среда «InVitro Gro HI», «Цельсис ИнВитро ГмбХ», Неусс, Германия), содержащей 1% (об./об.) пенициллин/стрептомицин и 0,05 % (об./об.) базового раствора дексаметазона (100 мкМ дексаметазона в этаноле), инкубированные в тех же условиях, но без препаратов. Контроль путем проведения микроскопического исследования показал отсутствие преципитатов при культивировании, за исключением культивирования при концентрации 2000 мкг/мл. Все испытуемые концентрации исследовались в виде 8-кратных повторений. Инкубация менялась в зависимости от рабочего раствора MTT в течение 1,5 ч. Рабочим раствором MTT были 2,5 мл базового раствора (5 мг/мл в PBS) + 7,5 мл среды для культивирования гепатоцитов. Превращение соли тетразолия (MTT) в формазан жизнеспособными клетками определялось фотометрически при длине волны 570 нм после лизиса клеток путем встряхивания в лизирующей буфере. Лизирующий буфер состоит из 39 % (об./об.) воды, 39% (об./об.) диметилформамида, 2 % (об./об.) уксусной кислоты, 20 % (м./об.) SDS. Выживаемость клеток   определялась как процентная доля сигнала от отрицательного контроля без объекта испытания. Натрия фторид в концентрации 250 мкг/мл служил положительным контролем.

Ингибирование цитохрома P450. Испытывались препараты омелы,  в концентрациях 0,2, 2,0 и 200 мкг/мл, с объединенными микросомами человеческой печени (0,5 мгмикросомального белка/мл) в 10 мМ калий-фосфатном буфере при pH 7,4 на предмет на активности цитохромов (CYP) 1A2, 2A6, 2B6, 2C8, 2C9, 2C19, 2D6, 2E1 и 3A4 посредством определенных маркерных реакций в присутствии 3 мМ магния хлорида и 2 мМ НАДФ-H на титрационном микропланшете на 96 лунок при температуре 37±0,5°C.  Культивирование проводилось в трех экземплярах. Общий объем отдельной клеточной культуры составлял 240 мкл. Концентрации веществ-маркеров в смесях для культивирования выбирались  близко к  значению кажущейся Km. Экстракт омелы или CYP-специфический ингибитор предварительно инкубировались с микросомальной суспензией в течение 5 –10 мин.  Культивирование начиналось путем добавления соответствующего вещества-маркера. Культивирование прекращалось через 30 ± 1 мин, так как скорость образования всех исследуемых метаболитов носила линейный характер во времени до 30 мин. Путем забора пипеткой 200 мкл смеси для культивирования переносили  в виалу, содержащую 200 мкл ледяного ацетонитрила в качестве стоп-реагента. Образцы центрифугировались при  ускорении 3000 × g (центробежное ускорение) в течение 10 мин при температуре 4°C.  Затем надосадочная жидкость (супернатант) переносилась на титрационный микропланшет на 96 лунок для тандемной ВЭЖХ-масс-спектроскопии для анализа и определения остаточных веществ-маркеров и образующихся в результате метаболитов. Образцы, в которые добавлялись известные количества веществ-маркеров и метаболитов-маркеров, использовались для построения калибровочных кривых для того, чтобы количественно определить вещества и метаболиты. Образцы культур, не содержащие объекта исследования и специфического ингибитора CYP, но имеющие идентичные концентрации соответствующего вида растворителя культур объектов исследования, служили в качестве отрицательных контролей ингибирования (ОК). Образцы культур, содержащие CYP-специфический ингибитор, использовались в качестве положительных контролей (ПК) ингибирования. Конечные концентрации веществ-маркеров в отдельной среде для культивирования были следующими: 2 мМ фенацетина для CYP1A2; 2 мМ кумарина для CYP2A6; 40 мМ бупропиона для CYP2B6; 4 мМ паклитаксела для CYP2C8; 4 мМ диклофенака для CYP2C9; 20мМ S-мефенитоина для CYP2C19; 8 мМ буфуралола для CYP2D6; 2 мМ хлорзоксазона для CYP2E1; 40 мМ тестостерона для CYP3A4. Определяемыми метаболитами были ацетаминофен для CYP1A2; умбеллиферон для CYP2A6; гидроксибупропион для CYP2B6, 6α-гидрокси-паклитаксел для CYP2C8, 4'-гидрокси-диклофенак для CYP2C9, 4'-гидроксимефенитоин для CYP2C19, гидроксибуфуралол для CYP2D6, 6'-гидроксихлороксазон для CYP2E1 и 6b-гидрокситестостерон для CYP3A4. Концентрации специфических ингибиторов CYP в образцах культур были следующими: 10 мкМ фурафиллина для CYP1A2; 0,3 мкМ 8-метоксипсорален для CYP2A6; 30 мкМ триэтилентиофосфамида для CYP2B6; 1 мМ кверцетина для CYP2C8; 0,8 мкМ сульфафеназол для CYP2C9; 3 мМ омепразола для CYP2C19; 120 мкМ хинидина для CYP2D6; 1,2 мМ натриевая соль диэтилдитиокарбаминовой кислоты для CYP2E1; 60 мкМ кетоконазола для CYP3A4 (FDA, 2006).

Индукция цитохрома P450. Препараты омелы испытывались на предмет индукции цитохрома Р450 (CYP)   в первичных культурах свежевыделенных человеческих гепатоцитов от трех отдельных доноров. Гепатоциты высеивались в 24-луночные планшеты с плотностью клеток 3×105 на лунку. Три препарата омелы были  в концентрациях 0,2, 2,0 и 4 мкг/мл. Потенциал индукции разных экстрактов в отношении изоферментов CYP 1A2, 2B6, 2C9, 2E1 и 3A4 определялся по соответствующим веществам-маркерам, как описано выше для ингибирования цитохрома Р450 (CYP), в сравнении с референтными индукторами. Культуры, содержащие референтные индукторы для CYP1A2 (омепразол, 50 мкМ), CYP2B6 (фенобарбитал, 1 мМ), CYP2C9 (рифампицин, 10 мкМ), CYP2E1 (этанол, 100 мМ) и CYP3A4 (рифампицин, 10 мкМ), соответственно, выступали в качестве референтных контролей индукции. Были исследованы по три повторения на каждый референтный контроль. После 48-часового  равновесия гепатоцитов при температуре 37°C в питательной среде для гепатоцитов, препараты омелы и референтные индукторы добавлялись к гепатоцитам в течение 72 ч с обновлением среды и реагентов для испытаний каждые 24 часа. За 72-часовым периодом индукции следовала 3-часовая инкубация гепатоцитов с веществами-маркерами. Реакции прекращались путем забора надосадочной жидкости и перемешивания с равным объемом ледяного ацетонитрила, за которым следовало центрифугирование для преципитации протеинов при температуре 4°C. Полученная в результате надосадочная жидкость использовалась для тандемной ВЭЖХ масс-спектроскопии для обнаружения и определения метаболитов.

Тандемная ВЭЖХ масс-спектроскопия. Разделение и обнаружение веществ-маркеров и метаболитов-маркеров достигается при использовании ВЭЖХ («Waters Alliance 2705», Эшборн, Германия) и масс-спектроскопии («Quatro LC», Micromass, Витеншэйв, Великобритания) на колонке C18 («Симметрия», 3,5 мкм, 4,6 × 75 мм, «Waters», Эшборн, Германия) с использованием C18-предколонки («Феноменекс», 4×3 мм, Ашафенбург, Германия). Параметры ВЭЖХ показаны в Таблице 1, параметры МС – в Таблице 2.

Анализ данных и критерии приемлемости исследования. Среднее n повторений рассчитывалось с использованием функции Excel «среднее». Холостая проба отнималась от среднего значения образцов перед выполнением дальнейших расчетов. SEM (стандартная ошибка среднего), % в сравнении с отрицательным контролем, и SE (стандартная ошибка) рассчитывались, как описано ниже, с использованием соответствующих функций Excel. Цитотоксический потенциал объектов испытания в испытуемом диапазоне предполагается, если (i) наблюдается снижение числа жизнеспособных клеток на протяжении (как минимум, снижение на 20 % OD570, в сравнении с отрицательным контролем), (ii) наблюдается зависимость «доза-эффект» (если одна концентрация демонстрирует снижение на 20% OD570, все более высокие концентрации должны демонстрировать более высокое снижение OD570). Испытание считается достоверным, если (i) положительный контроль вызывает снижение числа жизнеспособных клеток относительно отрицательного контроля (≤80 %), (ii) Среднее значение OD570 отрицательного контроля минус холостая проба составляет, как минимум, 0,1.

Анализ данных и критерии приемлемости индукции цитохрома Р450 (CYP). Анализ данных экспериментов по индукции цитохрома Р450 (CYP) проводился с использованием программного обеспечения: «MS-EXCEL™ 2002»  производителя «Microsoft, Inc.», «MassLynxTM Верс. 4.0» и «QuanLynxTM»  производителя «Micromass, Ltd». Среднее число n повторений рассчитывалось с использованием функции Excel «среднее». SEM (стандартная ошибка среднего), % в сравнении с отрицательным контролем, и SE (стандартная ошибка) рассчитывались с использованием соответствующих функций Excel.

Анализ данных и критерии приемлемости ингибирования цитохрома Р450 (CYP). Анализ экспериментальных образцов на предмет ингибирования цитохрома Р450 (CYP) учитывался, если были соблюдены следующие критерии:

(i) положительные контроли демонстрировали ингибирование CYP, как минимум, на 30 %, в сравнении с отрицательным контролем; (ii) минимум шесть рассчитанных путем обратных вычислений стандартов калибровки попали в диапазон ±15 %, за исключением стандартов калибровки при LLOQ (нижний предел количественного анализа), который  должен быть в диапазоне ±20 % номинального значения; (iii) по крайней мере, 2/3 образцов для КК должны быть в рамках диапазона ±15 % соответствующего номинального значения. 1/3 образцов для КК могут быть за пределами ±15 %, но не все повторения при одном и том же уровне концентрации. Анализ данных экспериментов по ингибированию CYP проводился с использованием стандартного программного обеспечения: «MS-EXCEL 2002™» от производителя «Microsoft, Inc.», «MassLynxTM Верс. 4.0» and «QuanLynxTM» от производителя «Micromass, Ltd».

Таблица 1. Параметры ВЭЖХ для веществ-маркеров и метаболитов-маркеров

Поддержка сайта