+ 375 17 283 17 38

+ 375 17 283 17 38

RU EN   

Фармакокинетика лектинов природной омелы после подкожной инъекции

Фармакокинетика лектинов природной омелы после подкожной инъекции

Roman Huber, Juergen Eisenbraun, Barbara Miletzki, Michael Adler, Rainer Scheer, Reinhild Klein, Christoph H. Gleiter

Реферат

Цель: Изучение фармакокинетики лектинов природной омелы (nML) можно считать принципиально важным элементом для дальнейших рациональных исследований препаратов омелы. Исследования, выполненные при внутривенном введении рекомбинантного рибосома-инактивирующего протеина типа II (rML), аналогичного nML, выявили короткий период полувыведения у онкобольных – примерно 13 минут. Это испытание фазы I, выполнявшееся в одном исследовательском центре по открытой схеме, имело целью описание фармакокинетики nML.

Методы: Оределение nML проводилось используя технику модифицированной цепной полимеразной реакции (PCR) (Imperacer®, Chimera Biotech) после однократной подкожной инъекции экстракта омелы (abnobaVISCUM® Fraxini 20мг), содержащего примерно 20 мкг nML на мл и имеющего разрешение на маркетинг, 15 здоровым добровольцам мужского пола в возрасте 18-42 лет. Вторичными целями были оценка безопасности, а также число активированных природных клеток-киллеров. (CD54+/CD94+).

Результаты: До инъекции ни у одного из добровольцев nML не обнаруживались, а после инъекции nML обнаруживались в сыворотке у всех добровольцев. Однако результаты варьировали в широких пределах от одного индивидуума к другому. Средняя и медианная пиковые концентрации достигались через 1 и 2 часа после инъекции, соответственно. У некоторых добровольцев nML все еще обнаруживались при завершающем обследовании - через 2 недели после инъекции. Инъекция приводила к повышению температуры и появлению гриппоподобных симптомов у всех добровольцев, однако никаких других более серьезных побочных эффектов не наблюдалось. Все симптомы, а также местные реакции в месте инъекции, полностью исчезали в пределах 4-95 суток. Число активированных природных клеток-киллеров (NK) оставалось неизменным.

Заключения: Природные ML из abnobaVISCUM® Fraxini 20мг обнаруживаются в сыворотке после однократной подкожной инъекции. Период, на протяжении которого они обнаружимы, имеет значительно большую продолжительность, чем при внутривенном введении rML. Подкожная инъекция этого препарата без обычного предварительного введения более низких доз (аллергическая проба) приводит к непродолжительному повышению температуры и появлению кратковременных гриппоподобных симптомов.

Ключевые слова: AbnobaVISCUM® Fraxini 20мг. Антропософские лекарственные средства. Здоровые добровольцы. Фитотерапия. Безопасность. NK-клетки.

Введение в лечение рака омелой

Препараты омелы использовались в течение десятилетий для поддерживающего лечения онкобольных в рамках концепции антропософских лекарственных средств. Несмотря на то, что было выполнено более 40 рандомизированных клинических испытаний, эффективность применения препаратов омелы при лечении рака пока еще до конца не выяснена и продолжает обсуждаться [1].Причиной этой неудовлетворительной ситуации является то, что тестированию подвергались различные препараты омелы, с различными ингредиентами и в различных концентрациях, а также то обстоятельство, что фармакология экстрактов омелы не выяснена. Активными ингредиентами экстрактов омелы являются главным образом природные лектины омелы (nML), вискотоксины и полисахариды. Из них наиболее интересными в отношении противораковой активности являются nML. В экспериментах, проведенных in vitro и на животных, было показано, что они обладают выраженными цитотоксическими свойствами [2,3]. В дозах ниже цитотоксического уровня nML стимулируют неспецифическую и специфическую иммунную систему человека [4].

ML являются гликопротеинами, и встречаются в природе в виде двух типов: рибосома-инактивирующих протеинов класса 2, подразделяемых на три субтипа: ML-I, -II и-III; и viscum album хитин-связывающих ML (cbML). Молекулярный вес nML I-III составляет около 63 кДа. Они имеют очень похожие биологические свойства и состоят из N-гликозидазы (А-цепь) и галактозид-распознающего лектина (В-цепь), соединенных дисульфидным мостиком [5,6].А-цепь ингибирует синтез протеинов [7,8]. В-цепь связывается с углеводными остатками на поверхности клетки, проникая таким образом в клетку путем эндоцитоза, опосредованного рецепторами, и вызывает апоптоз клетки [8,9]. СbML принадлежит к другому классу лектинов с   другой структурой, с низкой антигенностью, и молекулярным весом лишь примерно 11 кДа [10]. Он гораздо менее токсичен, чем nML I-III, и в наш анализ не включен.

Недавно была разработана методика обнаружения nML I-III в сыворотке человека в нанограммовых количествах [11,12]. Рекомбинантный рибосома-инактивирующий протеин типа II (rML), аналогичный nML I, показал короткий период полувыведения у онкобольных – примерно 13 минут [12]. Знание фармакокинетики nML можно рассматривать как важный элемент для оптимизации клинического применения и проведения дальнейших рациональных исследований препаратов омелы. Вследствие этого, мы впервые исследовали фармакокинетику nML, присутствующих в составе, поступающего в продажу, препарата омелы.

Пациенты и методы лечения рака

Это исследование выполнялось в одном исследовательском центре по открытой схеме как рандомизированное неконтролируемое клиническое испытание в фазе I. Первичной целью являлась фармакокинетика nML после подкожного введения одной дозы (1 мл) abnobaVISCUM® Fraxini 20мг здоровым добровольцам мужского пола. Вторичными целями были оценка безопасности, а также маркеры активации (CD54+/CD94+) природных клеток-киллеров (NK). Этот маркер был выбран потому, что лечение пациентов с метастатическим колоректальным раком и раком легкого NK-клетками (CD54+/CD94+), активированными протеинами после теплового шока, показали наличие многообещающих противоопухолевых эффектов [13]. Мы хотели проверить гипотезу, что повышение температуры, вызываемое омелой, активирует NK-клетки.

Это исследование включало в себя скрининг (обследование 1), период госпитализации (обследования 2-6), начиная с ночи перед подкожной инъекцией исследуемого лекарственного препарата (IMP) - и до момента спустя 72 часа после нее, а также завершающий период последующего наблюдения (обследование 7) – в День 14 ± 3 после инъекции IMP. Концентрации природных ML в сыворотке добровольцев анализировались до и спустя 0.3, 0.7, 1.0, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 18, 24, 36, 48, 72 b 336 часов после инъекции IMP. Биохимические показатели [креатинин, мочевина, мочевая кислота, натрий, калий, хлорид, кальций, креатин-киназа, аланин амин-трансфераза (ALT), аспартат амино-трансфераза (AST), лактат-дегидрогеназа, щелочная фосфатаза, гамма-глутамил-трансфераза, общий билирубин, общий протеин, альбумин, альфа-амилаза, С-реактивный протеин (CRP), холестерин, триглицериды, глюкоза] определялись при обследованиях 1, 2 и 7. NK-клетки CD54+/CD94+ определялись до инъекции и через 6, 24 и 72 часа после инъекции.

В исследование включались субъекты, удовлетворяющие следующим критериям: здоровые некурящие мужчины в возрасте от 18 до 45 лет, с показателем массы тела (BMI) 18.5 -28 кг/см2, нормальными значениями артериального давления, частоты пульса, температуры тела, гематологическими, биохимическими, коагуляционными показателями и электрокардиограммой (ЭКГ). Критериями, исключающими участие в исследовании, были признаки любого клинически значимого заболевания, регулярный прием лекарств, злоупотребление лекарствами, положительный результат исследования мочи на присутствие наркотиков, положительный результат анализа крови на этанол (алкоголь), участие в другом клиническом испытании, предшествующая терапия препаратами омелы, аллергический анамнез на какой-либо лекарственный препарат, аллергические заболевания, кроме случаев, когда исследователь сочтет их не имеющими значения для целей данного исследования, положительный серологический тест на ВИЧ, а также гепатиты В или С, регулярное употребление более 20 г этанола в день, сдача донорской крови в пределах 3 месяцев перед поступлением на исследование, ограниченный доступ к периферийным венам для забора крови, или неспособность понять природу и объем этого испытания. В исследования включались только те добровольцы, которые давали письменное согласие и удовлетворяли всем критериям для участия в нем. Перед началом исследования соответствующий комитет по этике давал положительный отзыв на проведение этого клинического испытания, и исследование проводилось в соответствии с нормами надлежащей клинической практики и принципами, изложенными в Хельсинкской декларации.

Лекарственный препарат

AbnobaVISCUM® Fraxini 20мг представляет собой инъекционный растительный не содержащий эндотоксинов экстракт европейской разновидности омелы Viscum album L., предназначенный для лечения злокачественных опухолей, их рецидивов и некоторых предраковых состояний. Поскольку abnobaVISCUM® Fraxini 20мг характеризуется самым высоким содержанием nML (приблизительно 20000 нг/мл) в сравнении со всеми прочими имеющимися в продаже препаратами омелы, он был выбран для того, чтобы обнаружить nML в нанограммовых количествах после подкожной инъекции. Омела паразитирующая на лиственных деревьях, таких как ясень, из которого получают abnobaVISCUM® Fraxini 20мг, содержит относительно высокую долю nML-I по сравнению с nML II/III [14], однако вследствие методологических трудностей в экстракте, поступающем в продажу, невозможно выполнить разделение различных разновидностей ML. Содержание cbML в abnobaVISCUM® Fraxini 20мг составляет приблизительно 1 мкг/мл [15]. Каждому добровольцу подкожно вводили одну и ту же дозу (1 мл) abnobaVISCUM® Fraxini 20мг. В корректировках дозы не было необходимости, поскольку критерий включения в исследование ограничивал показатель массы тела человека значениями 18.5 -28 кг/см2. Внутриопухолевые иньекции abnobaVISCUM® Fraxini 20мг приводили к весьма значительному уменьшению опухолей у пациентов с ксенотрансплантатами при раке поджелудочной железы [13].

Количественное определение nML и активированных NK-клеток

После отбора каждый образец крови немедленно охлаждался и центрифугировался в течение 10 минут при 4°С и при 2500 обор/мин. После этого, по меньшей мере 2 мл сыворотки немедленно замораживались и хранились при – 80 °С в клиническом испытательном центре. Содержание природных ML в сыворотке добровольцев измерялось с помощью исключительно чувствительного метода, основанного на цепной иммуно-полимеразой реакции (PCR) (Imperacer®, Chimera Biotech) [11,12,16], который сочетает в себе иммуносорбентный твердофазный анализ (ELISA) и экспоненциальное усиление сигнала, типичное для PCR. Этот метод прошел валидацию в Chimera Biotech GmbH, Дортмунд, Германия, в отношении определения содержания природных лектинов омелы в сыворотке крови человека после введения abnobaVISCUM®. Он не различает субтипы nML I – III. Он не обнаруживает cbML из-за их совершенно другой структуры. Говоря вкратце, антиген иммобилизировался на поверхности микропланшетов с покрытием, захватывающим антитела, непосредственно из образцов сыворотки, подвергающихся анализу без дополнительной очистки. Для сведения к минимуму фоновых эффектов образцы разбавлялись в соотношении 1:3 буфером для разбавления образцов, содержащим детергент. Параллельно с образцами производилось исследование серии разбавлений антигена. В качестве эталонных веществ использовались abnobaVISCUM® Fraxini 20мг, партия № 407В04 и abnobaVISCUM® Mali 20мг, партия № 502В33 (оба от ABNOBA GmbH, Германия). Для количественного определения антигена с помощью калибровочной кривой, а также проверки робастности и специфичности теста, использовались образцы с добавками. Образцы для каждой калибровочной кривой (6000 – 93.75 антигена пг/мл) готовились в не содержащей антигена сыворотке индивидуума, взятой до введения антигена. Образцы данной серии разбавлений дополнительно замораживались для того, чтобы имитировать влияние замораживания, которому подвергались антигенсодержащие образцы, предназначенные для анализа. После инкубации исследуемых образцов, а также образцов для построения калибровочной кривой, иммобилизованный антиген соединяли со специфичным конъюгатом антитело-ДНК. Этот анализ выполнялся с помощью набора Imperacer® (№ 11-030, Chimera Biotech, Германия), специально предназначенного для проведения анализа лектинов. В качестве антител для детектирования и захвата использовались моноклональные анти-ML антитела мышей 5F5 (А-цепь анти-ML-I) и 5Н8, анти-ML-A [Institut fuer Immuno praeparate und Naehrmeden(Институт иммунных препаратов и питательных сред) GmbH, Германия], соответственно.

После промывания, маркер ДНК усиливался в реальном времени за счет PCR. При анализе данных применялась корректировка по базовой линии. Программное обеспечение прибора вычисляет пороговый цикл (Ct), представляющий собой первый цикл PCR, при котором сигнал, несущий информацию, становится сильнее сигнала фона (порога), и устанавливает его в фазу, где этот сигнал увеличивается линейно. Корректировки на базовую линию и пороговое значение были идентичными во всех валидационных измерениях. Затем вычислялись значения ΔCt – путем вычитания значений Ct, полученных для каждого сигнала из общего числа циклов, выполненных в процессе эксперимента. Это чисто математическое преобразование облегчает сравнение данных с данными классического метода ELISA, поскольку значения ΔCt прямо пропорциональны концентрации антигена.

Точность, чувствительность, специфичность и робастность этого анализа были подходящими для выполнения данного фармакокинетического исследования. Полученный в процессе валидации диапазон линейности анализа с помощью Imperacer® соблюдается в пределах концентраций 0.1 – 100 нг nML/мл. С учетом того, что в одной дозе содержится 20000 нг nML, а объем сыворотки у человека составляет примерно 3000 мл, то можно ожидать максимальной концентрации 6.6 нг nML/мл, если предположить, что 100 % введенных nML будут немедленно распределены по кровеносной системе без метаболизации. Поскольку диапазон линейности измерений начинается с 0.1 нг, было возможно количественно измерять концентрацию nML если в кровеносной системе в каждой точке измерений появляется всего 5% от введенного количества 1 мл abnobaVISCUM® Fraxini 20мг. Ожидалось, что этого будет достаточно для успешного определения кинетических параметров. Граничное значение, выше которого концентрации nML получались положительными, было равным 0.1 нг nML/мл. Для идентификации NK-клеток использовалась гепаринизированная кровь, а одноядерные клетки периферийной крови (PBMC) выделялись с помощью градиента Fricoll’a. После окрашивания фикоэритрин-(РЕ)-конъюгировнными анти-CD56, перидинин-хлорофилл-протеин (РerСР)- конъюгировнными анти-CD45 и флуоресцеин-изоцианат (FITC)- конъюгировнными анти-CD94 антителами (все получены от Becton-Dickinson, San Jose, CA, США), PBMC подвергались инкубации с соответствующими антителами или контрольными антителами изотипов иммуноглобулина G (IgG) (BD Biosciences Pharmingen). Подсчитывалось как минимум 10000 лимфоцитов. Квадранты устанавливались в зависимости от контрольного изотипа для каждого антитела.

Статистика

Сравнения с контрольной группой не планировалось, и данных для сравнения получено не было. Поскольку это испытание должно было проводиться в исследовательских целях, то вычислений размеров образца на статистической основе не выполнялось. В исследование планировалось включить n=16 (две группы по n=8) здоровых добровольцев мужского пола, так как это достаточное число для того, чтобы получить возможность оценки фармакокинетики после однократной дозы abnobaVISCUM® Fraxini 20мг.

Для статистического анализа были определены две популяции участников испытания:

  1. Популяция, в которой изучалась фармакокинетика, включала всех участников, для которых были получены интерпретируемые и пригодные для оценки фармакокинетические результаты на протяжении 72 часов после введения дозы abnobaVISCUM® Fraxini 20мг.
  2. Популяция, в которой оценивалась безопасность препарата, охватывала всех участников, которые удовлетворяли критериям пригодности и были включены в испытания.

Анализы фармакокинетики nML и маркера иммунологической активации выполнялись для

Таблица 1. Демографические данные добровольцев.

 

Демографические характеристики (n=15)

Среднее арифметическое

Стандартное отклонение

Минимум

Медиана

Максимум

95 %-ный доверитель-ный интервал

Нижний предел

Верхний предел

Возраст (годы)

31,4

6,3

18,0

30,0

42,0

18,0

42,0

Рост (см)

181,3

6,4

171,0

180,0

193,0

171,0

193,0

Вес (кг)

78,0

10,4

65,0

74,0

99,0

65,0

99,0

Показатель массы тела (кг/м2)

23,7

2,4

20,3

23,5

27,7

20,3

27,7

популяции, в которой изучалась фармакокинетика. Оценка безопасности и переносимости выполнялась для популяции, в которой оценивалась безопасность препарата. Про возможности проводилась корректировка на недостающие и недостоверные данные. Если такой возможности не было, то такие данные считались отсутствующими.

Результаты

Скринингу подвергались 35 добровольцев, из них 20 были признаны пригодными. В отклонение от первоначально запланированного размера образца n=16, IMP вводился только 15 добровольцам; пятеро были исключены до получения препарата по причине появления новых критериев исключения в период между скринингом и госпитализацией. Демографические данные добровольцев представлены в Таблице 1. Природные ML не обнаруживались ни у одного из добровольцев до инъекции IMP, и обнаруживались у всех добровольцев после инъекции. Несмотря на то, что все добровольцы получали подкожные инъекции IMP от одного и того же опытного исследователя, индивидуальные профили изменения концентрации со временем значительно варьировали: Добровольцы 1-9 и 14 [10/15 (67 %)] показывали быстрый рост с высокими концентрациями nML, после чего следовал медленный спад. Второе повышение наблюдалось у добровольцев 2, 5, 9 и 14 (27 %). У остальных 5/15 (33 %) , т.е. добровольцев 10-13 и 15, профиль изменялся волнообразно и на низком уровне концентраций nML.

При завершающем обследовании (в день 14 ± 3 после инъекции) nML в сыворотке 5/15 добровольцев не обнаруживались, однако у 9/15 (60 %) nML все еще присутствовали в измеряемых концентрациях. У одного из добровольцев запланированное последнее измерение концентрации nML не было проведено, поскольку он не явился на завершающее обследование. Ход изменений концентраций nML показан на Рис 1, а фармакокинетические данные представлены в Таблицах 2 и 3. Средняя пиковая концентрация в сыворотке наблюдалась спустя 01:00 ч после введения дозы. К концу исследования кривая не вернулась, но почти вернулась к состоянию, существовавшему до введения дозы.

Средние арифметические значения максимальных концентраций в плазме Cmax , а также площадь под кривой зависимости концентрации в плазме от времени, от нуля до бесконечности (AUC0-∞), составили 1043 пг/мл и 8395 ч*пг/мл, соответственно. Значение Tmax варьировало в пределах от 0.3 до336.0 ч, при медианном значении 2.0 ч. Концентрация nML, равная 3.7 нг/мл, вычисленная для самого высокого сигнала, зарегистрированного в этом исследовании у добровольца 3 через 1 ч после инъекции, соответствует наличию 56 % лекарства в сыворотке для этой точки во времени (100 % = 6.6 нг/мл). Вычисление λz и t½ (t½ = ln2/ λz) ,было невозможно ни для одного из добровольцев из-за нелинейности профиля зависимости концентрации от времени.

На рисуке 1 Индивидуальные профили изменения концентраций природных лектинов омелы со временем (n=15).

По вертикали: Концентрация природных лектинов омелы (пг/мл).

По горизонтали: время (ч) после подкожной инъекции abnobaVISCUM® Fraxini 20мг.

Значение AUC(0- tпоследнее) определялось с помощью трапецеидального анализа. Значение AUC(tпоследнее-∞) для добровольцев2, 3, 9-13 и 15 определить не удалось, поскольку кривые концентрация nML - время не могли быть экстраполированы на бесконечность по причине их нелинейности. Для добровольцев 1, 4-8 и 14 в определении значения AUC(tпоследнее-∞) не было необходимости, поскольку концентрации nML уменьшались ниже порога обнаружения в период времени отбора образца крови. У добровольцев, чьи концентрации nML в сыворотке не уменьшались ниже порога обнаружения (100 пг/мл) в период отбора образца крови, т.е. у 10/15 (67 %) добровольцев, значения AUC0-∞ и CLsc(0-∞) не поддавались определению. После инъекции IMP доля активированных NK-клеток (CD54+/CD94+) в общем числе NK-клеток (CD16+/CD56+) существенно не изменялась по сравнению с базовой линией.

Серьезных побочных реакций не наблюдалось. Из 55 зарегистрированных побочных реакций 53 были классифицированы исследователем, как по меньшей мере связанные с IMP, причем у каждого из 15 добровольцев имел место один или более побочный эффект, имеющий по меньшей мере возможную причинную связь с IMP. Только 5 из 55 зарегистрированных побочных реакций, наблюдавшихся у 2/15 (13 %) добровольцев были значительно выражены (гриппоподобные симптомы у двоих и тошнота у одного). Как и ожидалось, местная воспалительная реакция на месте инъекции наблюдалась почти у всех участников (14/15, 93 %), а у 15/15 температура тела повышалась до >37.5°С (Рис. 2), что сопровождалось гриппоподобными симптомами у всех субъектов и тошнотой у восьми. Одиннадцать добровольцев (73.5 %) принимали сопутствующие лекарства из-за боли на месте инъекции во время госпитализации, а 3/15 – также после выписки из клинического исследовательского центра. У 12 добровольцев (80 %) воспалительная реакция сохранялась и после завершающего обследования: самый длительный период составил 95 дней.

Что касается оценки лабораторных данных, то при завершающем обследовании, проводившемся на 14-й (± 3) день после введения IMP, никаких клинически значимых отклонений от нормальных значений гематологических, биохимических и урологических показателей не наблюдалось (Таблица 4). На протяжении всего исследования ни у одного из добровольцев не было зарегистрировано какого-либо клинически значимого отклонения в ЭКГ. Во время общего обследования никаких клинически значимых нарушений, кроме местной воспалительной реакции на месте инъекции, выявлено не было.

Поддержка сайта